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空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物SRM1649b相關(guān)分析

發(fā)布時(shí)間: 2022-11-22  點(diǎn)擊次數(shù): 916次

空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物SRM1649b相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析方法:

1.多環(huán)芳烴化合物對(duì)表皮真皮細(xì)胞毒性效應(yīng)分析:永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞 NHDF 細(xì)胞為研究對(duì)象,以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b 浸出液為刺激物。研究不同時(shí)間條件下(0 小時(shí)、6 小 時(shí)、12 小時(shí)、24 小時(shí),36 小時(shí),48 小時(shí))不同濃度 SRM1649b 對(duì) HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響。傳代 HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞,顯微鏡下觀察有 70-80%的細(xì)胞 融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn),吸去原培養(yǎng)液,加入專用培養(yǎng)基,稀釋 SRM1649b,使其終濃度為 (0、50、100、200、400ug/mL),在不同濃度,不同時(shí)間條件下避光孵育,用 CCK8 法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)和濃度孵育 SRM1649b 對(duì) HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響; 從而探索出不同濃度,和不同時(shí)間點(diǎn) SRM1649b 浸出液對(duì) HaCaT 及 NHDF 細(xì)胞生存率 的影響并選擇適宜的實(shí)驗(yàn)濃度。


2. 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) SRM1649b 對(duì) HaCaT 和 NHDF 的細(xì)胞周期,及凋亡的影響。 采用細(xì)胞免疫熒光法觀察 空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b 浸出液刺激前后 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞內(nèi)芳香族化 合物受體 AhR 的分布變化;


3. 用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)各濃度實(shí)驗(yàn)組 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬 蛋白酶 MMP1,MMP3,MMP9 的 mRNA 表達(dá)情況。用 Western-blot 方法檢測(cè)各濃度實(shí)驗(yàn) 組 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP1 蛋白表達(dá)情況。用 ELISA 法檢測(cè)基質(zhì) 金屬蛋白酶 MMP1 蛋白的細(xì)胞外分泌情況;


4. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western-blot 方法檢測(cè) PAHs(SRM1649b 浸出液)與受 體(AhR)結(jié)合后引起的胞漿及核內(nèi)下游靶基因的變化,包括 ERK1/2, c-Jun 等調(diào)控 分子的磷酸化水平,以及 CYP1A1 等下游靶基因的 mRNA 表達(dá)水平;

5. 空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b分析加入 AhR 受體拮抗劑后對(duì) HaCaT 和 NHDF 中 MMP1,CYP1A1 等表 達(dá)的影響。


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